白凡，北京大学生命科学学院生物医学前沿创新中心研究员，农工党党员。在北京市海淀区颐和园路5号，这所知名高等学府的科研楼，白凡与他的团队致力于将先进的单细胞、单分子研究方法应用于重大医学疾病问题的研究，并不断取得新的突破，为医学发展做出新的贡献。

揭示调控细菌耐药和复苏的关键分子机制

2018年11月21日，国际著名学术期刊Cell子刊Molecular Cell以长文在线发表了北京大学生命科学学院生物医学前沿创新中心白凡研究团队关于细菌耐药机制的重要研究成果。

在题为“ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance”的研究论文中，白凡研究团队通过综合应用单细胞活体荧光成像技术和高通量质谱鉴定手段，发现了蛋白质沉淀聚合体的形成和解聚在调控细菌耐药和复苏过程中的关键作用，并进一步揭示细菌细胞的关键生理指标-ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)浓度的动态变化是促使蛋白质沉淀聚合体产生的分子机制。

细菌的耐药性是一种现象，具有同样基因组的细菌群体通过异质性的基因表达产生了一个细胞亚群，称为持留菌，它们能耐受抗生素治疗。持留菌形成的机制一直是细菌学研究中的热点。之前，持留菌的形成一直归因于细胞的休眠状态和生长停滞。在这些生理情况下，尽管抗生素结合到了其作用靶点，但由于细胞的代谢缓慢，抗生素无法对细菌造成伤害。在最新的研究中，研究人员通过在显微镜下对耐药细菌在撤除抗生素后复苏生长过程的单细胞观测，发现每个持留菌表现出不同的休眠深度，从而调控持留菌复苏生长所需时间的快慢。
    通过进一步的单细胞实时动态观察，白凡研究团队意外地发现伴随着细菌休眠深度的加深，细菌细胞内会出现明显的“小黑点”。通过蛋白荧光标记和高通量质谱鉴定，这些小黑点被证明是大量蛋白质沉淀产生的聚合体。沉淀聚合体的形成，导致细菌进入深度休眠状态；而当细菌需要复苏生长时，沉淀聚合体需要首先解聚，恢复细菌细胞内的蛋白质平衡分布。
    之后，白凡研究团队通过大量的单细胞实时荧光成像和分子生物学实验，深入揭示细菌细胞内ATP的耗竭，是导致蛋白质沉淀聚合体产生的分子机制。而当ATP得到补充，细菌准备复苏生长时，还需要两个重要的蛋白DnaK和ClpB协助沉淀聚合体的解聚。这项工作系统地阐明了耐药细菌进入不同休眠深度的表型差异和分子机制，首次揭示了决定细菌复苏生长所需时间快慢的关键生物学过程，并为消除细菌耐药提供了新的思路和药物靶标。
    这项工作是白凡课题组继在2016年揭示外排泵在细菌耐药中发挥重要作用之后在细菌耐药领域的又一重要突破。

揭示混合型肝癌分子特征和诊断标志物

原发性肝癌（简称肝癌）每年造成全球约70万病人死亡且过半死亡病例来自中国，其致死率在所有癌种中高居第二。肝癌主要分为三种类型，肝细胞癌(~80%)、肝内胆管癌(~15%)和混合型肝癌(~5%)。混合型肝癌兼具肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分，是预后最差的一种肝癌。目前，混合型肝癌的分子特征未知，缺乏准确诊断标志物，因此其精确诊断和靶向治疗一直是原发性肝癌领域的重大难题。

2019年5月23日，Cancer Cell以长文形式在线发表了张宁团队、白凡团队、中山大学肿瘤防治中心曾木圣团队和日本理化研究所(RIKEN)中川英刀团队联合主导的国际合作研究成果。在题为Genomic and Transcriptomic Profiling of Combined Hepatocellularand Intrahepatic Cholangiocarcinoma Reveals Distinct Molecular Subtypes的论文中，研究人员综合利用多种测序方法、数据分析和实验手段，系统研究了混合型肝癌三种病理亚型的基因组特征，提出了混合型肝癌分子分型标准，揭示了混合型肝癌中肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分的克隆起源关系，发现了新的诊断和预后标志物，这些结果为混合型肝癌的临床诊断、预后和治疗提供了关键信息。

此项研究中，白凡研究团队与其他团队合作，从天津肿瘤医院、中山大学肿瘤防治中心、日本广岛医学中心和新加坡总医院等8家医院收集了133例混合型肝癌病例的临床样本和病例信息进行研究。为了深入探究混合型肝癌中两种病理成分的克隆起源关系，此次研究根据两种成分的物理分布，将混合型肝癌分为三个亚型：Separate type (分开型)、Combined type (结合型) 和 Mixed type (混匀型)，并且针对三种亚型分别设计了针对性研究方案。

首先，经过外显子测序、全基因组测序和转录组测序，研究人员系统分析了混合型肝癌的高频驱动事件，包括体细胞突变、HBV插入位点、拷贝数变异，融合基因，结构变异，差异表达基因等，全面绘制了混合型肝癌的基因组图谱。随后通过同TCGA，ICGC等国际和国内组织发表的肝细胞癌和胆管细胞癌数据综合比较，研究人员发现，混合型肝癌中显著富集TP53突变，同时缺乏肝细胞癌中富集的CTNNB1突变，缺乏胆管细胞癌中富集的KRAS突变，该结果初步揭示了混合型肝癌独特的基因组特征。

其次，通过分子分型探究，研究人员发现Combined type (结合型)混合型肝癌同胆管细胞癌分子图谱相近，而Mixed type (混匀型)混合型肝癌同肝细胞癌分子图谱相近，而且研究人员发现这两种亚型的免疫微环境也存在较大差异，暗示其对免疫治疗的应答会有所不同。这些结果提示这两种病理类型混合型肝癌应该采取不同的治疗方案。

第三，通过激光显微切割，突变肿瘤细胞占比分析和单细胞测序等技术，研究人员分析和比较了混合型肝癌中的肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分，发现这两种成分既有单克隆起源也有多克隆起源。同时，通过重构亚克隆组分析，研究人员还推断了Separate type (分开型)的肿瘤转移路径，揭示了其表型转化和演化规律。

最后，研究人员发现Nestin蛋白表达可以作为混合型肝癌的诊断和预后标志物。免疫组化分析结果显示，Nestin 蛋白在混合型肝癌中的表达水平和阳性率均显著高于肝细胞癌和胆管细胞癌。通过分析预后数据，Nestin 阳性表达病例在混合型肝癌中呈现显著较差的预后，而且这一发现同样适用于肝细胞癌和肝内胆管癌。这些结果说明，Nestin蛋白可以作为混合型肝癌乃至肝细胞癌和肝内胆管癌的预后标志物。

在此项研究过程中，白凡团队发挥了重要作用。据了解，白凡实验室将继续聚焦以下研究方向：单细胞基因测序技术应用于癌症病人外周血循环肿瘤细胞研究，深入探索癌症转移的分子生物学机制及通过循环肿瘤细胞测序进行无创癌症诊断、预后判断、疗效评价的临床方法；大样本基因测序研究癌症发生、转移机制，针对明确的临床问题，采用基因测序手段研究中国人群高发癌症的基因突变特征，发掘引起癌症表型转化、转移的关键驱动事件；综合使用基因测序、荧光成像手段研究细菌行为、致病性，抗生素杀菌原理和细菌抗药、耐药的分子机制。（农萱）